一、培養(yǎng)基的配制
a. RPMI 1640 1× （with L-glutamine） 類培養(yǎng)基組分：RPMI ，10%FBS（胎牛血清），雙抗生素（penicillin，盤尼西林（青霉素）， streptomycin，鏈霉素）；
配制方法：500 ml RPMI(一瓶) + 50 ml FBS + 5 ml 雙抗生素
b. DMEM 1× 類培養(yǎng)基組分： DEMI，10% FBS，雙抗生素；
配制方法：500 ml DMEM(一瓶) + 50 ml FBS + 5 ml 雙抗生素
 
二、培養(yǎng)細胞RNA的提取
1.從培養(yǎng)箱中拿出6孔板（每孔培養(yǎng)2 ml），吸出培養(yǎng)液；
2.PBS清洗；用大槍管吸取PBS加入每個培養(yǎng)孔中（槍頭不要觸碰培養(yǎng)板，防止交叉污染），用1 ml槍吹勻清洗（把培養(yǎng)板傾斜，吸溶液指**高處打出）。重復以上操作一次。
3. 每孔中加1 ml Trizol ，吸出放-80℃冰箱冷凍。
 
三、培養(yǎng)細胞DNA的提取
1.從培養(yǎng)箱中拿出6孔板（每孔培養(yǎng)2 ml），吸出培養(yǎng)液；
2.PBS清洗；用大槍管吸取PBS加入每個培養(yǎng)孔中（槍頭不要觸碰培養(yǎng)板，防止交叉污染），用1 ml槍吹勻清洗（把培養(yǎng)板傾斜，吸溶液****高處打出）。重復以上操作一次。
3. 向培養(yǎng)板中加酶消化（時間較長，放進培養(yǎng)箱，看到有白色懸浮后取出），取出加DMEM類培養(yǎng)基；
4. 吸出** 1.5 ml 離心管，3600 rpm，4 min離心；
5. 吸出上清（不要觸及沉淀），加 PBS 1ml清洗，3600 rpm，4 min離心；
 
四、常用細胞系（人）
名稱          細胞類型             來源               核型                  培養(yǎng)液
A431          上皮型           表皮細胞腫瘤     非整倍體（76， XX）      DMEM+10%FBS
HeLa          上皮樣              宮頸癌        非整倍體（81-83，XX）     MEM+NEAA 10%FBS
Hep G2        上皮樣             肝細胞癌       非整倍體（55，XY）       MEM+NEAA 10%FBS
 
MEM：極限必需培養(yǎng)液（Eagle）；NEAA：非必需氨基酸；DMEM：Dulbecco’s MEM改良培養(yǎng)液；
RPMI：Roswell Park Memorial 研究所；BrdU：5-溴脫氧尿苷；APRI：腺苷磷酸核糖轉移酶
實驗室除snu系列與G產7721用1640培養(yǎng)基，其它用DMEM培養(yǎng)基。
五、原代培養(yǎng)----肝細胞
1.切除乳鼠肝臟組織放進小燒杯中，用PBS或培養(yǎng)液漂洗2-3次，去除血污；
2.加少量培養(yǎng)液，用剪子把組織剪碎，1 平方mm左右，再用吸管吹打；
3.加含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液，制成均勻的細胞懸液，移入培養(yǎng)瓶，將組織塊放在培養(yǎng)瓶底部，采用薄層營養(yǎng)液培養(yǎng)法，蓋上瓶蓋。
4.換液，只將舊的培養(yǎng)液吸棄，換上新的培養(yǎng)基。
 
六、傳代培養(yǎng)
1.顯微鏡觀察是否需要傳代
細胞生長良好：上清液清亮，無懸浮物，折光性好，均質而透明，胞膜完整，胞內顆粒少，無空泡和脂滴。
細胞生長不良：懸浮物多，發(fā)差增大，胞膜不完整，胞質中顆粒多，出現(xiàn)空泡和脂滴。
 
2.貼壁細胞傳代
①吸出瓶內舊培養(yǎng)液；
②用PBS輕緩漂洗細胞，兩遍，小皿，2 ml，大皿， 4 ml，盡量棄去舊培養(yǎng)液（防止消化液被稀釋，造成效力下降）；
③向培養(yǎng)皿中加入適量胰蛋白酶，37℃ 2-3 min，（消化標準：細胞突起回縮，細胞間隙增大，細胞近乎圓形）；
④加入一定培養(yǎng)液（小皿 1 ml,大皿 2 ml），終止消化反應，反復吹打貼壁細胞，制成細胞懸液；
⑤傳代/棄掉， 剩余的細胞懸液加新的培養(yǎng)液，小皿 4-5 ml,大皿 10-12 ml;
⑥貼上細胞名稱，代數(shù)，時間
 
3.懸浮細胞的傳代
懸浮細胞不貼壁生長，傳代時無需使用消化液處理；
懸浮細胞不貼附于支持物，胞體圓形，培養(yǎng)液中生長空間大，可長時間生長，便于做細胞代謝研究；
 
七、凍存細胞的復蘇（提前開水浴箱37℃）
1.常用的凍存液：甘油，DMSO（二甲基亞砜，**常用，常溫時對細胞有很強細胞毒作用，凍存過程中細胞代謝停止，不能發(fā)揮細胞毒作用）。
2.原則：快速融化，保證細胞外結晶在很短時間內融化，避免由于緩慢融化使水分溶入細胞內形成細胞內再結晶對細胞造成損傷；緩慢加液，加培養(yǎng)液時要慢，防止?jié)B透壓劇烈變化，造成細胞損傷；
加入冷的5-10倍的培養(yǎng)液充分稀釋凍存液，以使DMSO對細胞的毒性作用降到**低點。
3.步驟：
①提前將恒溫水浴箱調到37℃-42℃預熱；取離心管、培養(yǎng)皿（酒精燈滅菌）； 培養(yǎng)不同細胞，專管專用；
②將放在4℃冰箱平衡的細胞培養(yǎng)液拿出，用帶有消毒水的紗布擦后放進超凈臺，瓶經灼燒后將蓋擰松待用（避免開蓋時間過長，PH改變）；
③在刻度離心管中加入5-6 ml 的培養(yǎng)液；
④從液氮中取出凍存管，用鑷子夾其蓋部，在37℃溫水中快速搖動，管口不要遇水；#p#分頁標題#e#
⑤凍存管迅速過火開蓋，將底部細胞輕輕吹打起來，移**刻度離心管中；
⑥離心，離心對細胞不利，要低速離心，800-1000r/min, 3 min,實驗室1200r/min,5 min; 在6 cm培養(yǎng)皿中加入培養(yǎng)液；
⑦離心完畢，離心管過火，將凍存液一次性倒進廢液缸，管口過火，加入新鮮培養(yǎng)液，輕輕吹打，移**培養(yǎng)皿中；
⑧相差顯微鏡觀察細胞的狀況；復蘇標準：1.折光性：健康細胞立體感強，細胞內顆粒少，非常透明，折光率高；2.細胞是否完整，細胞是否飽滿。
 
八、細胞凍存：在體外培養(yǎng)細胞懸浮，加有冷凍保護劑（DMSO）的溶劑中，降**某溫度，并在此溫度長期保存。
原則：慢凍速融；緩慢凍存：可使細胞內的水分滲出細胞外，減少細胞內冰晶的形成，從而減少由于冰晶造成的細胞損傷；
凍存細胞：取10代以內為宜；
步驟：
1.配制凍存液；① 30%血清+60%培養(yǎng)液+10%DMSO；②細胞不好培養(yǎng)時：90%血清+10%DMSO；
2.對數(shù)生長的貼壁細胞，棄去舊培養(yǎng)液，PBS洗兩次；
3.加入胰酶消化，制成細胞懸液（懸浮生長則直接移**離心管中），800-1000 r/min離心5 min，棄上清；
4.加入凍存液，用吸管輕輕吹打，使細胞均勻，計數(shù)，凍存**終密度**少1×10的六次方；
5.按每管0.5-1 ml的量，將細胞懸液均勻裝入凍存管，擰緊管蓋；
6.標明凍存細胞名稱，日期，操作者；
7.凍存直接關系到細胞復蘇時的活力，分級凍存：4℃冰箱30min----轉入-20℃冰箱 30—60 min------轉入-70℃--80℃冰箱過夜---------將凍存管放入-196℃液氮罐中保存；
注意事項：①凍存**好為對數(shù)生長期細胞，凍存前****好換一次液；②凍存和復蘇**好用新的培養(yǎng)基；
③細胞低溫保存的關鍵是0—20℃的處理（在此溫度范圍內，冰晶呈針狀，極易導致細胞損傷）；④DMSO無需滅菌（滅菌會破壞其分子結構導致降低冷凍效果）
 
九、收細胞
1.用槍將培養(yǎng)基吸棄；
2.1 ml PBS洗（一定要輕柔，防止將細胞吸去）用槍將棄液吸棄；
3.再加1 mlPBS吹打細胞，（因293T細胞是半貼壁細胞，不用胰酶消化）將細胞全部吸打到液體中；
4.將液體轉入1.5 ml EP管，離心2000—3000 R，3—5 min;
5.用槍頭吸凈上清；
6.冷凍**-80℃冰箱；
若為貼壁細胞：1.將舊培養(yǎng)基吸棄；2.加胰酶消化細胞；3.加入新培養(yǎng)液中和胰酶；4.將液體轉入1.5 ml EP管，離心，棄上清；6.用1 ml PBS 清兩遍，棄凈上清；7.凍**-80℃冰箱；
 
二、提取RNA
一、工作臺處理及RNA專用器材；用Erasol 處理工作臺面；RNase-free 的槍頭，EP管；
二、試劑準備
1.Trizol試劑；
2.氯仿（提RNA專用）；
3.異丙醇（提RNA專用）；
4.75%乙醇（DEPC水配制）；
5.高壓處理的DEPC水：1000 ml雙蒸水加入1 mlDEPC，37℃過夜，高壓；
三、操作步驟
1.細胞處理：棄培養(yǎng)液，用預冷的PBS洗2遍，加入Trizol(小皿加1 ml,大皿加2 ml;關鍵步驟，含醋酸鈉，在酸性環(huán)境RNA與蛋白質分離，DNA不分離，DNA與蛋白質被沉淀下來)，混勻，室溫靜置5 min;
2.反復吹打，將液體轉入1.5 ml EP管中，加入0.2 ml氯仿，劇烈震蕩15 S，靜置5 min;
3.4℃離心，12000 g，15 min，樣品分三層，取上清（注意不要吸到中間的白色層，否則易造成DNA污染）；
4.加入0.5 ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10 min;
5.4℃離心，12000 g 10min,棄上清；
6.加入1 ml 75%乙醇，輕輕洗滌沉淀，4℃離心，8000 g 5min，棄上清；
7.冰上晾干，加入適量的DEPC水溶解（20 ul）；
8.取適量RNA進行濃度測定和電泳檢樣，剩余的RNA立即放-70℃冰箱保存；
評價RNA質量的標準是RNA的均一性和完整性
均一性：OD是光密度值，A是吸光值，是同一個意思；A260是核酸（RNA/DNA）**大吸光值的波長；A280是蛋白質**大吸光值的波長（A260/280比值可估計核酸純度）；純DNA的A260/A280是1.8，純的RNA是2.0；比值太低說明有殘留的蛋白質，比值過高說明RNA降解；
完整性：由于細胞中大部分RNA是rRNA，因此在理想的電泳圖上能看到的條帶有兩個，28S、18S，且28S是18S的兩倍，如果RNA發(fā)生降解，則上述兩條帶變弱或消失，出現(xiàn)一條分子量很小的條帶；
 
 
組織蛋白提取 2014/4/2
                        RIPA
提取蛋白的lysis buffer:    PI(蛋白抑制劑)
                        PMSF
把磨好的組織粉末加入2 ml離心管，加入200 ml lysis buffer,裂解30 min，12000 rpm離心