一、名詞解釋
1、 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)： 指從體內(nèi)組織取出細(xì)胞在體外模擬體內(nèi)的環(huán)境使其生長(zhǎng)繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)
2、 原代培養(yǎng)：取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。    
3、 傳代培養(yǎng)：細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長(zhǎng)一定時(shí)間后，被分開(kāi)接種到新的培養(yǎng)器皿中。
4、 細(xì)胞系：原代細(xì)胞**傳代成功后即可成為細(xì)胞系
5、 細(xì)胞株：通過(guò)選擇法或克隆法形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得特殊性質(zhì)或標(biāo)志，并保持這些特性的培養(yǎng)物。
6、 培養(yǎng)用液：培養(yǎng)液是維持細(xì)胞生存和生長(zhǎng)所需的基本溶液。除培養(yǎng)液外，還有各種雜用液。培養(yǎng)用液主要分為三類：平衡鹽溶液、天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基。
7、 天然培養(yǎng)基：在細(xì)胞培養(yǎng)中使用**早，也**有效，主要來(lái)自動(dòng)物體液或從組織中分離提取制備的成分，其營(yíng)養(yǎng)性較高，但成分復(fù)雜，個(gè)體差異較大，另外在來(lái)源上也有一定的限制。
8、 貼壁依賴性：細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)需要附著于某些帶適量正電荷的固體或半固體表面，大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)，均以此種方式生長(zhǎng)。
9、 合成培養(yǎng)基：按人和動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞所需成分模擬合成的、配方恒定的一種較理想的培養(yǎng)基。但對(duì)動(dòng)物細(xì)胞來(lái)說(shuō)，它也只能維持細(xì)胞的生存，要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，還需補(bǔ)充部分天然培養(yǎng)基，即把兩者混合在一起使用，效果才更好。合成培養(yǎng)基的出現(xiàn)，促進(jìn)了組織培養(yǎng)的發(fā)展，減少了生物個(gè)體差異的影響。
10、 平衡鹽溶液BSS ：是從Ringer 生理鹽水發(fā)展起來(lái)的，主要由無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖組成。BSS 中的無(wú)機(jī)離子不僅是細(xì)胞生命所需成分，而且對(duì)維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)溶液的酸堿度方面，起著重要作用。
 
二、簡(jiǎn)答題
1、細(xì)胞凍存與復(fù)蘇要點(diǎn)與注意事項(xiàng)
細(xì)胞凍存要點(diǎn)
　　(1)冷凍過(guò)程要緩慢.需要冷凍保存的細(xì)胞先在4℃冰箱中放置 30-60分鐘;然后轉(zhuǎn)入-20℃,放置30分鐘;然后再轉(zhuǎn)入-80℃放置16-18小時(shí)(或過(guò)夜);**后放入液氮中長(zhǎng)期保存.有條件的地方,可用程控降溫儀,按每分鐘-1 到 -3℃速度降溫,一直到-80℃以下,然后直接放入液氮中長(zhǎng)期保存.
　　(2)凍存細(xì)胞必須處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,活力大于90%,無(wú)微生物污染.
　　(3)細(xì)胞濃度控制在:1×107-5×107/ml.
　　(4)使用高濃度血清或蛋白保護(hù)劑.一般情況下,用于冷凍保存完全細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液中血清濃度大于20%.
(5)使用合適的細(xì)胞冷凍保護(hù)劑,以保護(hù)細(xì)胞在冷凍過(guò)程中免受冰晶破壞.目前,**常用的冷凍保護(hù)劑是DMSO(二甲基亞砜),使用終濃度為5-10%.但是,有些細(xì)胞系不能用DMSO作為冷凍保護(hù)劑,如人白血病細(xì)胞系HL-60.因?yàn)?DMSO能誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化.在這種情況下,可選用其它冷凍保護(hù)劑,如甘油(glycele),羥乙基淀粉等. 　
注意事項(xiàng) 
　　(1)細(xì)胞在冷凍過(guò)程中在-20℃冰箱內(nèi)放置時(shí)間不可超過(guò)1小時(shí),以防止冰晶過(guò)大而破壞細(xì)胞.也可跳過(guò)-20℃這一步驟直接放入-80℃冰箱中,但這樣做細(xì)胞存活率要低一些.
　　(2)DMSO稀釋時(shí)會(huì)釋放大量熱量.因此,DMSO不能直接加到細(xì)胞液中,必須事先配制.
　　(3)DMSO 必須是細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)別的.新買的DMSO本身處于無(wú)菌狀態(tài),**次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管或瓶中,4℃保存.避免反復(fù)凍融造成DMSO裂解產(chǎn)生有害物質(zhì).并可減少污染機(jī)會(huì).如要過(guò)濾DMSO,必須選用耐DMSO的尼龍濾膜. 細(xì)胞冷凍保存液主要成分:冷凍保護(hù)劑,基礎(chǔ)培養(yǎng)液,血清或蛋白.
冷凍保存細(xì)胞復(fù)蘇要點(diǎn)與注意事項(xiàng):
　　細(xì)胞復(fù)蘇要點(diǎn)
(1)從液氮中取出凍存的細(xì)胞,立即放入37℃水浴中快速解凍.
　　(2)將1-2ml 凍存細(xì)胞液加入到25ml新鮮完全細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液中,輕輕混勻.
　　(3)用80g 離心2-3分鐘,棄上清液.
　　(4)用完全生長(zhǎng)培養(yǎng)液輕輕懸浮細(xì)胞團(tuán),并計(jì)數(shù)細(xì)胞.
(5)接種細(xì)胞到培養(yǎng)瓶中,起始密度為3×10⁵/ml.
     注意事項(xiàng) 
　　(1)解凍時(shí)務(wù)必注意安全,預(yù)防冷凍管爆裂.,要帶手套,用鑷子將細(xì)胞冷凍管從液氮中取出,放入37℃水浴中.切不可直接用手,以免凍傷.
　　(2)冷凍管在水浴中解凍時(shí),液面不可超過(guò)凍存管蓋面,否則,易發(fā)生污染.
　　(3)快速解凍.凍存細(xì)胞從液氮中取出后,應(yīng)立即放入37℃水浴中,輕輕搖動(dòng)冷凍管,使其在1分鐘內(nèi)全部融化(不要超過(guò)3分鐘).
　　(4)解凍操作過(guò)程動(dòng)作要輕.由于冷凍保存過(guò)的細(xì)胞變得非常脆弱,不僅解凍速度要快,而且動(dòng)作要輕.一般情況下,解凍后的細(xì)胞可直接接種到含完全生長(zhǎng)培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中直接進(jìn)行培養(yǎng)(1ml 凍存細(xì)胞液加入到25-30ml新鮮完全培養(yǎng)液中),24小時(shí)后再用新鮮完全培養(yǎng)替換舊培養(yǎng)液,以去除DMSO.如果,細(xì)胞對(duì)冷凍保護(hù)劑特別敏感,那么,解凍后的細(xì)胞應(yīng)先通過(guò)離心去除冷凍保護(hù)劑,然后再接種到含完全生長(zhǎng)培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中.
2、細(xì)胞培養(yǎng)基本條件
（1）合適的細(xì)胞培養(yǎng)基
　　合適的細(xì)胞培養(yǎng)基是體外細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的**重要的條件之一,培養(yǎng)基不僅提供細(xì)胞營(yíng)養(yǎng) 和促使細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的基礎(chǔ)物質(zhì),而且還提供培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的生存環(huán)境.#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
（2）優(yōu)質(zhì)血清 
　　目前,大多數(shù)合成培養(yǎng)基都需要添加血清.血清是細(xì)胞培養(yǎng)液中**重要的成分之一,含有細(xì)胞生長(zhǎng)所需的多種生長(zhǎng)因子及其它營(yíng)養(yǎng)成分.
（3）無(wú)菌無(wú)毒細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境 
　　無(wú)菌無(wú)毒的操作環(huán)境和培養(yǎng)環(huán)境是保證細(xì)胞在體外培養(yǎng)成功的shou要條件.在體外培養(yǎng) 的細(xì)胞由于缺乏對(duì)微生物和有毒物的防御能力,一旦被微生物或有毒物質(zhì)污染,或者自身代謝物質(zhì)積累,可導(dǎo)致細(xì)胞中毒死亡.因此,在體外培養(yǎng)細(xì)胞時(shí),必須保持細(xì)胞生存環(huán)境無(wú)菌無(wú)毒,及時(shí)清除細(xì)胞代謝產(chǎn)物.
（4）恒定的細(xì)胞生長(zhǎng)溫度 
　　維持培養(yǎng)細(xì)胞旺盛生長(zhǎng),必須有恒定適宜的溫度.
（5）合適的氣體環(huán)境 
氣體是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生存必需條件之一,所需氣體主要有氧氣和二氧化碳. 細(xì)胞培養(yǎng)基種類與基本成分 細(xì)胞培養(yǎng)基的種類很多,按其來(lái)源分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基(目前使用的培養(yǎng)基jue大部分是合成培養(yǎng)基),按其物質(zhì)狀態(tài)分為干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基兩類.干粉培養(yǎng)基需由實(shí)驗(yàn)者自己配制并滅菌,液體培養(yǎng)基由專業(yè)商家提供,用戶可直接使用,非常方便.每種細(xì)胞都有其合適的培養(yǎng)基,
3、常用的合成培養(yǎng)基種類
(1).MEM細(xì)胞培養(yǎng)基系列
(2).DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基系列
(3)RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基系列
(4).199細(xì)胞培養(yǎng)基系列
(5).水解乳蛋白細(xì)胞培養(yǎng)基
(6)歐氏平衡鹽
(7)F-10,F-12細(xì)胞培養(yǎng)基系列
(8)其它類型細(xì)胞培養(yǎng)基
4、傳代細(xì)胞分散后要經(jīng)歷的那些階段，什么階段細(xì)胞繼代**合適
細(xì)胞傳一代后，一般要經(jīng)過(guò)以下三個(gè)階段：
1．潛伏期（Latent Phase）。
    細(xì)胞貼附于支持物后，除先經(jīng)過(guò)前述延展過(guò)程變成極性細(xì)胞，還要經(jīng)過(guò)一個(gè)潛伏階段，才進(jìn)入生長(zhǎng)和增殖期。細(xì)胞處在潛伏期時(shí)，可有運(yùn)動(dòng)活動(dòng)，基本無(wú)增殖，少見(jiàn)分裂相。細(xì)胞潛伏期與細(xì)胞接種密度、細(xì)胞種類和培養(yǎng)基性質(zhì)等密切相關(guān)。初代培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長(zhǎng)，約24～96小時(shí)或更長(zhǎng)，連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期短，僅6～24小時(shí)；細(xì)胞接種密度大時(shí)潛伏期短。當(dāng)細(xì)胞分裂相開(kāi)始出現(xiàn)并逐漸增多時(shí)，標(biāo)志細(xì)胞已進(jìn)入指數(shù)增生期。
2．指數(shù)增生期（Logarithmic growth Phase）：這是細(xì)胞增值**旺盛的階段，只要營(yíng)養(yǎng)充分，細(xì)胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)量仍在增多。但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時(shí)，細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制（Density Inhibition），導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。
3．停滯期（Stagnate Phase）：細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后，細(xì)胞遂停止增殖，進(jìn)入停滯期。此時(shí)細(xì)胞數(shù)量不再增加，故也稱平頂期（Plateau）。停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動(dòng)，繼而培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、pH降低。
指數(shù)增生期末更適宜細(xì)胞繼代
5、簡(jiǎn)述細(xì)胞計(jì)數(shù)步驟 
1、將血球計(jì)數(shù)板及蓋片用擦試干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。
2、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。
3、靜置3分鐘。
4、鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按下式計(jì)算：
細(xì)胞數(shù)/ml＝4大格細(xì)胞總數(shù)/ 4×10000
注意：鏡下偶見(jiàn)由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說(shuō)明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。
6、簡(jiǎn)述細(xì)胞污染的種類，及檢測(cè)方法
細(xì)胞污染種類有細(xì)菌，真菌，支原體，外源病毒
細(xì)菌和真菌檢測(cè)方法
可用TG,GA，GP檢測(cè)，
TG渾濁表示污染細(xì)菌，GA斜面有白色污染物表示有真菌污染
GP混住表示有真菌污染。
支原體污染的檢測(cè)
支原體檢測(cè)可用液體培養(yǎng)基和支原體固體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基變色只能懷疑有支原體污染，移植后仍有同樣顏色變化，或固體培養(yǎng)基出現(xiàn)荷包蛋樣菌落則判斷污染支原體。
    外源病毒檢測(cè)
致細(xì)胞病變病毒的檢驗(yàn)
紅細(xì)胞吸附病毒的檢驗(yàn)
特定病毒的檢驗(yàn) 
     細(xì)胞系來(lái)源動(dòng)物的原代細(xì)胞；
     對(duì)疫苗使用對(duì)象動(dòng)物致病性病毒敏感的細(xì)胞；
     對(duì)相應(yīng)病毒敏感的細(xì)胞。
     間接免疫熒光試驗(yàn) 
     PCR試驗(yàn)
7  細(xì)胞傳代要點(diǎn)與注意事項(xiàng)
細(xì)胞傳代方法
1、貼壁細(xì)胞
（1）洗掉舊培養(yǎng)液；
（2）、用無(wú)鈣鎂PBS洗滌細(xì)胞一**二次；
（3）、加入適量Trypsin-EDTA溶液
方法一：37℃或溫室作用數(shù)分鐘，于倒立顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞將要分離而呈現(xiàn)圓顆粒狀時(shí)，洗掉消化液，輕敲培養(yǎng)瓶邊緣使細(xì)胞自瓶壁脫落，然后加入適量的新鮮培養(yǎng)液，與脫落的細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)塊混合均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移**新的培養(yǎng)瓶中，依正常條件繼續(xù)培養(yǎng)之。
 方法二：37℃或室溫作用數(shù)分鐘，待細(xì)胞自瓶壁脫落后，加入適量含血清的新鮮培養(yǎng)液，以終止trypsin作用，離心后除去上清液，或不作離心處理，添加新鮮培養(yǎng)基后依稀釋比例傳**新的培養(yǎng)瓶中，依正常條件繼續(xù)培養(yǎng)之。#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
2、懸浮型細(xì)胞
（1）、吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，放入離心管中，離心1000rpm、5min
（2）、吸除上清液，加入適量的新鮮培養(yǎng)基，與沉淀細(xì)胞混合均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移**新的培養(yǎng)瓶中，依正常條件繼續(xù)培養(yǎng)。
細(xì)胞傳代時(shí)注意事項(xiàng)
（1）、紫外消毒過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生臭氧分子，對(duì)人體有害。一般情況下，消毒后**少半個(gè)小時(shí)后再進(jìn)入。
（2）、所有的實(shí)驗(yàn)器材都要經(jīng)過(guò)消毒處理，所有的細(xì)胞操作都在安全柜中進(jìn)行，每一步都要注意不要用手碰到瓶口，培養(yǎng)液不能碰到瓶口，拿培養(yǎng)瓶時(shí)要使培養(yǎng)瓶的瓶口微微翹起。
（3）、細(xì)胞消化時(shí)間不能太長(zhǎng)，要讓細(xì)胞盡快脫離不舒服的環(huán)境，補(bǔ)加生長(zhǎng)液后要保證細(xì)胞完全混勻，在顯微鏡下觀察細(xì)胞是一個(gè)一個(gè)的。
（4）、傳代培養(yǎng)時(shí)要注意無(wú)菌操作并防止細(xì)胞之間的交叉污染。所有操作要盡量靠近酒精燈火焰。每次**好只能進(jìn)行一種細(xì)胞的操作。每一種細(xì)胞使用一套器材。PBS，培養(yǎng)液和消化液應(yīng)嚴(yán)格分開(kāi)。
（5）、每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，掌握好細(xì)胞是否健康的標(biāo)準(zhǔn)：健康細(xì)胞的形態(tài)飽滿，折光性好，生長(zhǎng)**致密單層后即可傳代。
8   細(xì)胞培養(yǎng)目的與用途
 藥物研究與開(kāi)發(fā) 
　　(1) 新藥篩選:如化學(xué)合成藥物藥效研究,中藥有效成分篩選與鑒定等.
　　(2) 疫苗研究與開(kāi)發(fā):如病毒性疫苗的研究與開(kāi)發(fā)(肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗等),腫瘤疫苗(多肽疫苗)等.
　　(3) 基因工程藥物研究與開(kāi)發(fā):如干擾素研究與開(kāi)發(fā),細(xì)胞生長(zhǎng)因子研究與開(kāi)發(fā)等.
　　(4) 細(xì)胞工程藥物研究與開(kāi)發(fā):生物活性多肽研究與開(kāi)發(fā),人參皂甙,紫杉醇等生物活性成分研究與開(kāi)發(fā).
　　(5) 單克隆抗體制備:包括診斷用單克隆抗體,治療用單克隆抗體.
　　基礎(chǔ)研究 
　　(1) 藥物作用機(jī)理
　　(2) 基因功能
　　(3) 疾病發(fā)生機(jī)理
 生物制藥 
　　(1) 疫苗生產(chǎn):如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗等),腫瘤疫苗(多肽疫苗)等.
(2) 基因工程藥物生產(chǎn):如在臨床醫(yī)學(xué)中具有治療價(jià)值的一些細(xì)胞生長(zhǎng)因子如干擾素,粒細(xì)胞生長(zhǎng)因子,胸腺肽等
(3) 診斷用和藥用單克隆抗體生產(chǎn)
(4) 細(xì)胞工程藥物生產(chǎn):生物細(xì)胞內(nèi)的一些生物活性多肽,生物活性物質(zhì)等
9   無(wú)菌操作要求
（1） 手指不能觸及使用端。如觸及，器材需更換或灼燒后再使用
（2） 減少手與器材的接觸面，學(xué)會(huì)手指操作。
（3） 一切操作，如打開(kāi)或封閉瓶口，安裝吸管、注射器等，都要在火焰前方進(jìn)行。使用前需經(jīng)過(guò)火焰消毒后方可使用。
（4） 瓶口順風(fēng)斜放在支架上，試劑用后立即封閉瓶口。瓶口長(zhǎng)時(shí)間敞開(kāi)會(huì)增加落菌的機(jī)會(huì)。
（5） 不同的細(xì)胞同時(shí)操作時(shí)，要專管專用，并要勤換吸管，防止擴(kuò)大污染和交叉污染。
（6） 瓶口液滴不能倒回瓶?jī)?nèi)。盡量用酒精棉球擦拭，瓶口再經(jīng)火焰消毒。
（7） 操作者動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，盡量避免空氣流動(dòng)。
10  清洗玻璃器皿（新、舊）
舊的不知如何描述好！待補(bǔ)充！！！
清洗后的玻璃器皿：干凈透明無(wú)油跡、不能殘留任何物質(zhì)
包括浸泡、刷洗、浸酸和沖洗四個(gè)步驟
浸泡：初次使用和培養(yǎng)使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附著物軟化或被溶掉
› 新的初次使用的玻璃器皿，在生產(chǎn)及運(yùn)輸過(guò)程中，玻璃表面帶有大量的干固的灰塵，且玻璃表面常呈堿性及帶有一些對(duì)細(xì)胞有害的物質(zhì)等
› 先用自來(lái)水簡(jiǎn)單刷洗，然后用5％稀鹽酸液浸泡過(guò)夜，以中和其中的堿性物質(zhì)
› 再次使用的玻璃器皿則常附有大量剛使用過(guò)的蛋白質(zhì)，干固后不易洗掉
› 用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有氣泡或浮在液面上
刷洗：
› 用毛刷沾洗滌劑刷洗，以除去器皿表面附著較牢的雜質(zhì)
› 刷洗要適度，過(guò)度會(huì)損害器皿表面光澤度
浸酸：玻璃器皿浸泡到清潔液中
› 清潔液對(duì)玻璃器皿無(wú)腐蝕作用，而其強(qiáng)氧化作用可除掉刷洗不掉的微量雜質(zhì)
› 浸泡時(shí)器皿要充滿清潔液，勿留氣泡或器皿露出清潔液面
› 浸泡時(shí)間：一般為過(guò)夜，不應(yīng)少于6 小時(shí)
清潔液 常用三種：重鉻酸鉀（g）濃硫酸（ml）蒸餾水（ml）
›   強(qiáng)清潔液     63∶1000∶200
› 次強(qiáng)清洗液    120∶ 200∶1000
›   弱清潔液    100∶ 100∶1000
配制時(shí)應(yīng)注意安全，須穿戴耐酸手套和圍裙，并要保護(hù)好面部及身體裸露部分。配制過(guò)程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)，配制溶液應(yīng)選擇塑料制品。配成后清潔液一般為棕紅色。
11  胰蛋白酶的配制方法
（1） 按照試驗(yàn)需要稱取酶粉，用少量D-HANKs液將胰蛋白粉調(diào)成糊狀。
（2） 加適量D-Hanks液（橙紅色），低速磁力攪拌（室溫和4°間段進(jìn)行，室溫高于30°時(shí)要減少胰酶在室溫下的攪拌時(shí)間）直**酶液溶解。
（3） 溶解后的酶液（深紅色），濾過(guò)除菌，小瓶分裝，-20°C凍存。#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
12   血清滅活
待補(bǔ)充！！！
血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。
血清中含有：
①多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）②多種金屬離子 ③激素； ④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。⑤各種生長(zhǎng)因子⑥轉(zhuǎn)移蛋白⑦不明成分
常用血清有胎牛血潔、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量**好。
優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)細(xì)菌、支原體、病毒污染。
血清的滅活
(1) 選用與血清瓶同規(guī)格的對(duì)照瓶一個(gè)
(2) 對(duì)照瓶?jī)?nèi)放入魚(yú)血清等體積的水
(3) 溫度預(yù)試：水浴鍋2-3支體溫計(jì)56°
(4) 血清滅活、消除補(bǔ)體活性：56 ℃ ，30 分鐘
(5) 大瓶血清滅活后進(jìn)行分裝
(6) 分裝后，抽樣做無(wú)菌試驗(yàn) -20~-70°保存
13  培養(yǎng)細(xì)胞的生命期
所謂培養(yǎng)細(xì)胞生命期，是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長(zhǎng)的時(shí)間。
1．原代培養(yǎng)期：
也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到**次傳代階段，一般持續(xù)1一4周。此期細(xì)胞呈活躍的移動(dòng)，可見(jiàn)細(xì)胞分裂，但不旺盛。初代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)上相似性大。細(xì)胞群是異質(zhì)的，也即各細(xì)胞的遺傳性狀互不相同，細(xì)胞相互依存性強(qiáng)。如把這種細(xì)胞群稀釋分散成單細(xì)胞，在軟瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞克隆形成率很低，即細(xì)胞獨(dú)立生存性差。克隆形成率即細(xì)胞群被稀釋分散成單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，形成細(xì)胞小群（克隆）的百分?jǐn)?shù)。初代培養(yǎng)細(xì)胞多呈二倍體核型；由于原代培養(yǎng)細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞性狀相似性大，是檢測(cè)藥物很好的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。
2．傳代期：
初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系。在全生命期中此期的持續(xù)時(shí)間**長(zhǎng)。在培養(yǎng)條件較好情況下，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細(xì)胞稱二倍體細(xì)胞系。為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。當(dāng)前世界上常用細(xì)胞均在不出十代內(nèi)凍存。如不凍存，則需反復(fù)傳代以維持細(xì)胞的適宜密度，以利于生存。但這樣就有可能導(dǎo)致細(xì)胞失掉二倍體性質(zhì)或發(fā)生轉(zhuǎn)化。一般情況下當(dāng)傳代10～50次左右，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以**完全停止，細(xì)胞進(jìn)入第三期。
3．衰退期：
此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，**后衰退凋亡。在細(xì)胞生命期階段，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點(diǎn)（多發(fā)生在傳代末或衰退期），由于某種因素的影響，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得永生性或惡性性。細(xì)胞永生性也稱不死性，即細(xì)胞獲持久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱無(wú)限細(xì)胞系，也稱連續(xù)細(xì)胞系。無(wú)限細(xì)胞系的形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細(xì)胞獲不死性后，核型大多變成異倍體。細(xì)胞轉(zhuǎn)化亦可用人工方法誘發(fā)，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞也可能具有惡性性質(zhì)。細(xì)胞永生性和惡性非同一性狀。