細胞培養知識

VERO細胞培養、純化滅活的狂犬病毒

vero細胞
　　Vero細胞被成功的用來培養狂犬病疫苗、乙腦疫苗等多種疫苗，在非典期間又為研究冠狀病毒做出貢獻，在醫藥研究種廣泛應用。
來源： 非洲綠猴腎細胞 形態：上皮細胞 生長特性：貼壁
注釋：該細胞是日本千葉大學的Y. Yasumura和Y. Kawakita于1962年3月27日從一只正常的成年非洲綠猴腎組織培養出來的。
培養液：MEM（ 含 2 mM L-谷氨酰胺 和 Earle's BSS，1.5 g/L NaHCO3, 0.1 mM 非必需氨基酸, 1.0 mM 丙酮酸鈉）， 10%胎牛血清
傳代：吸去培養液。 用 0.25% (w/v) Trypsin- 0.53 mM EDTA洗一次，以去除血清（血清會抑制胰酶的活性）。 加2-3毫升Trypsin-EDTA，放在37℃培養箱內約5分鐘，直到細胞全部脫落。 加6-8毫升培養液，用移液器把細胞吹散。 加適量的細胞到新的培養器皿中。（以1:3**1:6為宜，傳代期間培養液每周更換2-3次）
凍存： 95%培養液+5%DMSO凍存于液氮。
CHO-K1細胞
 
 
 
　
　CHO-K1細胞是實驗中非常常用的一個細胞株，在生物制藥中使用也非常廣泛。該細胞株培養條件簡單，貼壁強度適中，比較容易轉染，很適合用它來研究一般哺乳動物基因的功能。
來源：Cricetulus griseus (中G倉鼠) 卵巢 形態：表皮細胞 生長特性：貼壁
注釋：CHO-K1由CHO衍生而來，CHO是T. T. Puck 在1957年從一只成年中G倉鼠卵巢獲得的（1）。
培養液：Ham's F12K （含2 mM L-谷氨酰胺，1.5 g/L NaHCO3）， 10% 胎牛血清。
傳代：吸去培養液。 用0.25% (w/v) Trypsin- 0.53 mM EDTA洗一次，以去除血清（血清會抑制胰酶的活性）。 加2-3毫升Trypsin-EDTA，放在37℃培養箱內約5分鐘，直到細胞全部脫落。 加6-8毫升培養液，用移液器把細胞吹散。 加適量的細胞到新的培養器皿中。（以1：4到1：8為宜，傳代期間培養液更換1-2次）
凍存：95%培養液+5%DMSO凍存于液氮。
1. Puck TT , et al. Genetics of somatic mammalian cells III. Long-term cultivation of euploid cells from human and animal subjects. J. Exp. Med. 108: 945-956, 1958. PubMed: 13598821
293細胞
　　
 
 
 
293細胞比較容易轉染，是一個很常用的表達研究外源基因的細胞株。293細胞的一個衍生株：293T/17的轉染效率更高，成為廣大研究者研究基因功能的一個強大工具。
　　293細胞的缺陷是生長過程中貼壁強度比較小。所以在實驗過程中容易流失，從而影響實驗結果。如果一個實驗室新得到的293細胞是郵寄得到的并且細胞在培養瓶中，就需要讓細胞沉降幾天時間，因為大量細胞會漂浮在培養液里。
來源：人體腎臟 形態：上皮細胞 生長特性：貼壁 注釋：該細胞含腺病毒5 DNA 。
培養液： MEM（ 含 2 mM L-谷氨酰胺 和 Earle's BSS，1.5 g/L NaHCO3, 0.1 mM 非必需氨基酸, 1.0 mM 丙酮酸鈉）， 10% 馬血清（熱滅活）。
傳代： 吸去培養液。 用0.25% (w/v) Trypsin- 0.53 mM EDTA洗一次，以去除血清（血清會抑制胰酶的活性）。 加2-3毫升Trypsin-EDTA，放在37℃培養箱內約5分鐘，直到細胞全部脫落。 加6-8毫升培養液，用移液器把細胞吹散。 加適量的細胞到新的培養器皿中。（以1：2到1：4為宜，傳代期間培養液2-3天更換1次）
凍存：95%培養液+5%DMSO凍存于液氮。
NIH-3T3細胞
　
 
 
　NIH-3T3細胞在實驗室常用來做轉染及基因表達的研究。易感病毒有鼠肉瘤病毒和鼠白血病毒。
來源： Mus musculus（小家鼠）胚胎 形態：成纖維細胞樣 生長特性：貼壁
注釋：為得到適合轉染得細胞株，NIH-3T3細胞**少連續克隆過5次。NIH-3T3細胞容易轉染DNA，鼠痘病毒陰性。
培養液：DMEM（含4mM L-谷氨酰胺、4.5g/L葡萄糖、1.5g/L碳酸氫鈉），10%小牛血清
傳代：吸去培養液。（不要讓細胞長滿培養器皿，長滿80%為宜） 用 0.25% (w/v) Trypsin- 0.53 mM EDTA洗一次，以去除血清（血清會抑制胰酶的活性）。 加2-3毫升Trypsin-EDTA，放在37℃培養箱內約5分鐘，直到細胞全部脫落。 加6-8毫升培養液，用移液器把細胞吹散。 加適量的細胞到新的培養器皿中。（以3-5x103/cm2為宜，傳代期間培養液每周更換2次）
凍存： 95%培養液+5%DMSO凍存于液氮。
PC-12細胞
PC-12細胞是一個常用的神經細胞株。
來源： Rattus norvegicus (褐家鼠) 腎上腺嗜鉻細胞瘤（一種交感神經系統的腫瘤）
形態：多角型細胞 生長特性：貼壁較松，容易成團
注釋：PC-12細胞株來源于一種可移植的鼠嗜鉻細胞瘤，該細胞對神經生長因子（NGF）有可逆的神經元顯形反應，該細胞不合成腎上腺素。#p#分頁標題#e#
培養液：Ham's F12K （含2 mM L-谷氨酰胺，1.5 g/L NaHCO3）+15%馬血清+2.5% 胎牛血清。
傳代：吸去培養液。 加入新的培養液，用吸管吹下細胞或用手拍打培養瓶或刮下細胞到培養液中，用移液器把細胞吹散。 加適量的細胞到新的培養器皿中。（以1：4為宜，傳代期間2-3天更換培養液）
凍存：95%培養液+5%DMSO凍存于液氮。
Hela細胞
　
 
 
　Hela細胞是在所有細胞株中****的。它來源于美G的Helen Lane，她1951年死于子宮頸癌。但源自她的腫瘤的細胞卻在世界各地的實驗室中得到廣泛的使用。
來源：人宮頸癌 形態：上皮細胞 生長特性：貼壁
注釋：Hela細胞顯角蛋白免疫沉淀染色陽性，包含HPV-18序列，有正常水平的pRB和p53的低水平表達。
培養液：MEM（ 含 2 mM L-谷氨酰胺 和 Earle's BSS，1.5 g/L NaHCO3, 0.1 mM 非必需氨基酸, 1.0 mM 丙酮酸鈉）， 10%胎牛血清
傳代：吸去培養液。 用0.25%（w/v）Trypsin-0.53 mM EDTA洗一次，以去除血清（血清會抑制胰酶活性）。 加2-3毫升Trypein-EDTA，放37℃培養箱內約5分鐘，直到細胞全部脫落。 加6-8毫升培養液，用移液器把細胞吹散。 加適量的細胞到新的培養器皿中。（以1：2到1：6為宜，每周傳代2-3次）
凍存：95%培養液+5%DMSO凍存于液氮。
Sf9細胞
　　Sf9細胞常在Baculovirus（桿狀病毒）表達系統中用作宿主細胞，來表達外源蛋白。
來源： Spodoptera frugiperda （草地夜蛾）卵巢細胞 形態：上皮細胞 生長特性：貼壁
注釋：Sf-9細胞是由G.E. Smith 和 C.L. Cherry 在1983年從細胞株IPLB-SF 21 AE得來的一個克隆。IPLB-SF 21 AE是1977年由Vaughn等從草地夜蛾蛹的卵巢組織得到的。
培養液：TNM-FH培養液：照廠家的說明配好Grace's Antheraea 培養液，每升培養液加3.3g酵母粉和3.3g乳白蛋白水解物，用1M KOH調pH到6.2-6.4過濾除菌，4℃保存。完整培養液在使用前加入10%熱滅活的胎牛血清。
傳代：用吸液管吹洗細胞使其懸浮，或用手從側面拍打細胞培養瓶(當用大細胞培養瓶時)重懸細胞。（當用來接種的細胞重懸前就有很多細胞漂浮，要吸掉漂浮細胞及舊培養液，加入新培養液重懸細胞。 按合適比例傳代細胞到新培養器皿中。 （以1：5或更多為宜，每2-3天傳代一次） 28℃培養（不用CO2培養箱）。
凍存：95%培養液+5%DMSO凍存于液氮。
BHK21細胞
來源：敘利亞倉鼠腎細胞 形態：纖維原細胞 生長特性：貼壁
注釋：這個細胞來自于一只出生**的新生倉鼠，隨后被改造成一個易于作表達的宿主細胞株。
培養液：MEM（ 含 2 mM L-谷氨酰胺 和 Earle's BSS，1.5 g/L NaHCO3, 0.1 mM 非必需氨基酸, 1.0 mM 丙酮酸鈉）+ 10%胎牛血清
傳代：吸去培養液。 用0.25%（w/v）Trypsin-0.03 mM EDTA洗一次，以去除血清（血清會抑制胰酶活性）。 加2-3毫升Trypein-EDTA，放37℃培養箱內約5分鐘，直到細胞全部脫落。 加6-8毫升培養液，用移液器把細胞吹散。 加適量的細胞到新的培養器皿中。（以1：2到1：10為宜，每周傳代1-2次）
凍存：95%培養液+5%DMSO凍存于液氮。
HepG2細胞
　　Hep G2細胞來源于一個15歲白人的肝癌組織。該細胞分泌多種血漿蛋白：清蛋白、α2-巨球蛋白、血纖維蛋白溶酶原、鐵傳遞蛋白等。該細胞能大容量培養，乙肝表面抗原陰性，對G418有抗性，對人生長激素有刺激反應。
來源： 人肝癌細胞 形態：上皮細胞 生長特性：貼壁
注釋：該細胞表達3-羥基-3-甲基戊二酸輔酶A還原酶和肝甘油三酸脂脂肪酶。該細胞在有百草枯(英文名：gramoxone)的環境下過氧化氫酶mRNA表達增加，ApoA-I mRNA 表達減少。
培養液：MEM（ 含 2 mM L-谷氨酰胺 和 Earle's BSS，1.5 g/L NaHCO3, 0.1 mM 非必需氨基酸, 1.0 mM 丙酮酸鈉）+ 10%胎牛血清。
傳代：吸去培養液。 用 0.25% (w/v) Trypsin- 0.53 mM EDTA洗一次，以去除血清（血清會抑制胰酶的活性）。 加2-3毫升Trypsin-EDTA，放在37℃培養箱內約5分鐘，直到細胞全部脫落。 加6-8毫升培養液，用移液器把細胞吹散。 加適量的細胞到新的培養器皿中。（以1:4**1:6為宜，傳代期間培養液每周更換2次）
凍存： 95%培養液+5%DMSO凍存于液氮。

DNA熒光染色法檢測細胞培養中的支原體污染

原理：利用熒光染料（bisbenzimide,Hoechst33258）檢測支原體污染。這種染料會結合到DNA的A-T福集區域，因為支原體的DNA中A-T含量高（55%-80%），所以可將其染色而檢測。被支原體污染的細胞經染色后在細胞核外與細胞周圍可看到許多大小均一的熒光小點，即為支原體的DNA，證明有支原體污染。
特點:簡單、經濟與靈敏，廣泛使用，可作為例行的檢測手段。可以檢測不易培養的支原體，例如M.hyorhinis，比直接培養法快，約一周既可知道結果。
缺點：有時會有背景熒光，影響結果判斷。
材料：
· Hank's balanced salt solution （不含NaHCO3 和酚紅，HBSS，GibcoBRL 21250-014）、二苯并噻唑（bisbenzimide，Hoechst No.33258，Sigma B-2883）、thimerosol（Sigma T-5125）、0.1M檸檬酸、0.2M磷酸氫二鈉、甘油、冰醋酸、甲醇、無菌水、chamber slide（Nunc 177380）或其替代物：35或60mm細胞培養皿內放無菌22x22mm蓋玻片（浸于酒精中用前過火滅菌），染色后取出蓋玻片細胞面朝下放玻片上觀察。
· 指示細胞：Vero（ATCC CCL-81或CCRC60013）或3T6（ATCC CCL-96或CCRC60070），細胞須先測試無污染。MEM，10%FBS（Vero的培養液）。
試劑準備：
· 無菌HBSS：配置Hank's balanced salt solution，用0.22um無菌濾膜過濾除菌。
· Hoechst 33258 儲存液（100x）：稱取5.0mg二苯并噻唑和10.0毫克thimersol溶于100ml無菌HBSS，置于棕色瓶中，室溫下以電磁攪拌器攪拌30分鐘**完全溶解后，以1ml/支分裝到1.5ml小離心管中，-20℃保存。
· Hoechst 33258 工作液：取1ml儲存液加入100ml無菌HBSS中，室溫下攪拌45分鐘，置于棕色瓶中并以錫箔紙包裹，避廣光保存于4℃。
· 封固溶液（mounting solution）：22.2ml0.2M 檸檬酸和27.8ml0.2M Na2HPO4加入50ml甘油中，用1N NaOH調pH**5.5（pH很重要），4℃保存。
· 固定液：冰醋酸：甲醇=1：3（v：v），用前配置。
步驟：
1. 培養Vero細胞：Vero細胞可作長期培養或制作多個凍存管，測試前解凍培養。測試前一周培養Vero細胞。
2. 在接種待測樣品前一日，將Vero細胞以1-2x104細胞/ml培養于chamber slide中，每孔加入1ml細胞懸浮液，于37℃，5%CO2培養。隔日確定生長良好后即可接種待測樣品細胞。
3. 接種待測樣品：樣品種類：1ml待測的培養基，1ml待測的細胞培養液（可刮下少許細胞）0.05-0.1ml 冷凍管的細胞懸浮液。
4. 將待測樣品加入chamber slide內培養5天后，進行Hoechst 33258的熒光染色觀察。
5. 以Acholeplasma laidlawii ATCC 23206感染Vero細胞作陽性對照，陰性對照用Vero細胞的新鮮培養基（MEM +10%FBS）。
DNA熒光染色檢測：
1. 取出培養5天的Vero細胞，吸除培養液。每孔加2ml固定液，靜置十分鐘后吸除固定液，重復一次，風干10分鐘。
2. 每孔加入1mlHoechst 33258 工作液，室溫下靜置30分鐘。
3. 吸掉Hoeshst 33258染液后，用無菌水洗滌3次，風干后加入1滴封固溶液，并以蓋玻片蓋之。
4. 用100-400x熒光顯微鏡觀察。打開汞燈10分鐘后，用UV激發光（330-380nm）的濾光鏡，觀察細胞核外是否有蘭色熒光小點或絲狀點的熒光。
結果判斷：如有支原體污染，在Vero細胞核外與細胞表面會出現蘭色熒光小點或絲狀點。其形狀一致，與細胞殘片染成的不規則點狀物不同。其熒光可維持數周。（見上圖）
怎樣查到一個特定細胞株的相關知識和培養條件？
　　ATCC (American Type Culture Collection) 收集了jue大多數細胞的詳細資料。打開ATCC網頁的Cells and hybridomas鏈接，輸入細胞名稱就可以搜索ATCC的細胞數據庫。
　　數據庫中有每一種細胞的詳細描述，包括細胞的來源，培養和凍存條件，以及相關文獻等資料。
為什么大多數細胞培養需要用二氧化碳培養箱？
　　一般細胞培養液的pH在7.0-7.4之間。由于碳酸鹽pH緩沖系統是一種生理pH緩沖系統（它是人體血液中**重要的pH緩沖系統），大多數培養液用它來保持穩定的pH。用粉末配制培養液時，常常需要加入一定量的碳酸氫鈉。
　　對大多數以碳酸鹽作為pH緩沖系統的培養液而言，以為了維持穩定的pH，培養箱中的二氧化碳需要維持在2-10%之間，以保持培養液中溶解的二氧化碳的濃度。同時細胞培養的器皿需要一定程度的透氣，以便于氣體的交換。
　　是不是采用其他pH緩沖系統就不需要二氧化碳培養箱了呢？人們發現由于空氣中的二氧化碳濃度很低，如果細胞不在二氧化碳培養箱中培養，培養液中的HCO3-會被耗盡，這樣會影響細胞的正常生長。所以大部分動物細胞的培養，還是需要二氧化碳培養箱。
　　細胞培養液中常附加其他的pH緩沖系統，比如HEPES緩沖系統，來增加pH緩沖能力。HEPES在pH7.2-7.4之間有很強的緩沖能力，當透氣的培養器皿被拿到二氧化碳培養箱外面的時候，由于空氣中二氧化碳濃度很低，培養液中碳酸鹽緩沖系統就會失去效果，這時候HEPES緩沖系統就能繼續保持pH的穩定。#p#分頁標題#e#

怎樣化凍動物細胞？
　　化凍過程的原則是要讓凍存的細胞快速融化。
　　如果細胞儲存在液氮液面下，使用者**好準備好必要的防護器具（**少要戴上護目鏡，**好戴上面罩和較厚的手套），防止進入凍存管的液氮驟然膨脹引起爆炸而造成傷害。從冰箱或液氮罐取出細胞后將凍存管放 37℃水浴輕輕晃動使之化凍完全，注意不要讓水浸到蓋子以防污染發生。
　　由于大多防凍劑與細胞長時間接觸時對細胞有毒害，所以**好盡快除去細胞凍存時加入的防凍劑。#p#分頁標題#e#
　　防凍劑的去除方式和細胞的敏感性有關。有些細胞在某些防凍劑存在的條件下能很好的貼壁生長，可以直接將化凍的凍存細胞連同其凍存液加入預備好 15-20ml 培養液的細胞培養瓶或培養皿中，輕輕混勻后放入培養箱培養過夜后換培養液。
　　對于敏感細胞要加入 10ml 培養液中， 100xg 離心 5 分，去上清后加培養液輕輕重懸細胞，加入培養器皿后在培養箱培養，第二天更換培養液。