【實驗目的】
1.學習掌握細胞培養(yǎng)的基本原理以及具體方法，并對小鼠脾細胞進行原代培養(yǎng)；
2.掌握無菌操作的具體過程及無菌操作臺的使用；
3.學習掌握染色法鑒別細胞的生死狀態(tài)的原理及方法；
4.學習使用血球計數(shù)板對細胞總數(shù)及活細胞數(shù)進行計數(shù)；
【實驗原理】
1.細胞培養(yǎng)
細胞培養(yǎng)指的是在無菌條件下，把動、植物細胞從組織中取出，在體外模擬體內的生理環(huán)境，使離體的細胞在體外生長和繁殖，并且維持其結構和功能的一種培養(yǎng)技術。動物細胞培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。從供體獲得組織細胞，在無菌條件下，用胰蛋白酶消化或機械分散等方法，將動物組織分散成單個細胞開始**培養(yǎng)長出單層細胞的方法稱為細胞的原代培養(yǎng)。當培養(yǎng)的動物細胞生長增殖達到一定密度，形成致密的單層細胞時，用胰蛋白酶將細胞消化分散成單細胞，從一個容器中以1：2或其他比例轉移到另一個容器中擴大培養(yǎng)的方法，稱為細胞的傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)的累計次數(shù)就是細胞的培養(yǎng)代數(shù)。
高等生物是由多細胞構成的整體，在整體條件下要研究單個細胞或某一群細胞在體內的功能活動是十分困難的。但如果把活細胞拿到體外培養(yǎng)、增殖并進行觀察和研究，則要方便和簡單得多。被培養(yǎng)的動物胞是非常好的實驗對象和實驗研究材料，對體外培養(yǎng)的活細胞進行研究可以幫助人類揭開生、老、病、死的規(guī)律，探索優(yōu)生、抗衰老和防治各種疾病的途徑和機制，也可以人為地誘導和改變細胞的遺傳性狀和特性，使其向有利于人類健康長壽的方向發(fā)展。因此動物細胞體外培養(yǎng)技術是研究細胞分子機制非常重要的實驗手段，被廣泛應用于醫(yī)學、生物技術、基因工程等研究*域。
細胞培養(yǎng)的意義
具有其他生物技術無可比擬的優(yōu)點；培養(yǎng)條件易改變和控制，便于單因子分析；便于人們直接對細胞內結構、細胞生長及發(fā)育等過程的觀察；在生物學的各個*域（如分子生物學、細胞生物學、遺傳學、免疫學、腫瘤學及病毒學等）已被廣泛應用。
細胞培養(yǎng)的局限性：在脫離機體復雜環(huán)境下，細胞培養(yǎng)條件與軀體環(huán)境有一定距離；觀察到的結果有時難以正確反映機體內的狀況；細胞培養(yǎng)得到的產物少。培養(yǎng)細胞的條件有水的質量、無菌環(huán)境，**適溫度、滲透壓、氣體條件、**適PH、營養(yǎng)條件和培養(yǎng)基質等。
2.細胞死活鑒定
細胞生死狀態(tài)的鑒別方法主要是化學染色法和熒光染色法。
活細胞和死亡細胞在生理技能和性質上主要存在一下差異：
①細胞膜通透性的差異：活細胞的細胞膜是一種選擇性膜，對細胞起保護和屏障作用，只允許物質選擇性地通過；而細胞死后，細胞膜受損，其通透性增加。基于此，發(fā)展出了以臺盼藍、伊紅、苯胺黑、赤蘚紅、甲基藍以及熒光染料碘化丙啶或溴化乙啶等為染料鑒別細胞生死狀態(tài)的方法，上述染料能使死亡細胞著色，而活細胞不被著色。此外，應用植物質壁分離的性質也可鑒定植物細胞的生死狀態(tài)。活細胞的原生質具有選擇透過性，死細胞因其原生質的選擇透過性已遭破壞，故與高滲透壓溶液接觸時不產生質壁分離。
②代謝上的差異：活細胞中新陳代謝作用強，細胞內的酶具有較強的活性和還原能力。基于此，發(fā)展處了以熒光素二乙酸酯（FDA）、熒光素二丙酸酯、熒光素二丁酸酯或熒光素二苯甲酰酯等酯化的熒光素鑒別細胞生死狀態(tài)的方法，上述酯化的熒光素親脂性提高，容易被細胞吸收進入，活細胞內的酯酶具有較強的活性，可將酯化的熒光素分解而釋放出能發(fā)熒光的熒光素，該物質不能自由透過活的細胞膜，積累在細胞內，熒光顯微鏡下顯示有明亮的綠色或黃綠色熒光；而死亡細胞內的酯酶因失去活性，不能分解酯化的熒光素，熒光顯微鏡下顯示不發(fā)光。另外，可用亞甲基藍為染料鑒定酵母細胞的生死狀態(tài)。亞甲基藍是一無毒染料，氧化型為藍色，還原型為無色。活細胞因具有較強的還原能力，能使亞甲藍從藍色的氧化型
變成無色的還原型，故活的酵母細胞在用亞甲基藍染色后顯示無色；死亡酵母細胞或代謝緩慢的衰老酵母細胞，因無還原能力或還原能力極弱，使亞甲藍仍處于氧化態(tài)，故呈現(xiàn)藍色或淡藍色。
3.血球計數(shù)板的使用
血球計數(shù)板是一塊特制的厚載玻片，載玻片上有4條槽而構成3個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個半邊上面各有一個方格網(wǎng)如圖（3)。每個方格網(wǎng)共分
9大格，其中間的一大格又稱為計數(shù)常被用作微生物的計數(shù)。計數(shù)室的刻度有兩種：一種是大方格分為16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格；另一種是一個大方格分成25
個中方格，而每個中方格又分成16個小方格。但是不管計數(shù)室是哪一種構造，它們都有一個共同特點，即每個大方格都由400個小方格組成(圖4)每個大方格邊長為1mm，則每一大方格的面積為1mm²每個小方格的面積為1/400mm²，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與計數(shù)室底部之間的高度為0.1mm，所以每個計數(shù)室(大方格)的體積為0.1mm³，每個小方格的體積為1／4000mm³。使用血球計數(shù)板直接計數(shù)時，先要測定每個小方格(或中方格)中微生物的數(shù)量，再換算成每毫升菌液(或每克樣品)中微生物細胞的數(shù)量。
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圖1 血球計數(shù)板構造（上、平面圖；下、側面圖） 圖2血球計數(shù)板的網(wǎng)絡分區(qū)與分格
【實驗用品】
1.材料：
小鼠脾臟；
2.試劑：
PBS緩沖溶液、培養(yǎng)液、伊紅；
3.器材：
解剖剪、解剖鑷、眼科剪、眼科鑷、培養(yǎng)皿、紗布塊、吸管、橡皮頭、燒杯、移液槍、注射器、針頭、Eppendorf管（上述器具徹底清洗、消毒、烤干、包裝好）、倒置相差顯微鏡、酒精燈、酒精棉球、試管架、解剖板等。
【操作步驟】
A.原代脾細胞培養(yǎng)
1、取材：
取小白鼠一只，采用斷頭法處死，清水洗凈小白鼠并浸于75%酒精中滅菌3min，取出轉入超凈工作臺內的解剖盤內，無菌操作打開腹腔，取出脾臟，去除周圍的脂肪組織，鑷起脾臟用PBS液自上而下沖洗1-2次，轉入無菌玻璃培養(yǎng)皿中，待用。
2、分離脾細胞：
形用滴管先向上述無菌玻璃培養(yǎng)皿中滴入 PBS液30滴，再用L行針頭注射器在皿內吸取
PBS液0.2ml，然后將其沿脾臟長軸方向注射入脾內，用針尖在脾臟上扎眼，并用L形針頭輕刮脾臟表面擠出脾細胞，用滴管吸皿中的PBS液沖洗脾臟并吹散掛出的脾細胞，稍微傾斜并靜置1-2min，吸取上述靜置后的脾細胞懸液上清部分放入Eppendorf管，以3000轉/分離心1-2min
3、培養(yǎng)脾細胞：
從超凈工作臺中區(qū)塑料培養(yǎng)皿一個，用“槍（1ml）”加入細胞培養(yǎng)液2ml，并在皿上做記號，待用。取上述離心后的Eppendorf管，在超凈工作臺內打開棄去上清液，用“槍（200μl）
”吸取塑料皿中的培養(yǎng)液400ul加入棄去上清液的Eppendorf管中用槍頭吹勻管底的脾細胞，
然后吸取200ul脾細胞懸液接種于上述塑料培養(yǎng)皿中，混勻，然后放入37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
B.細胞死活鑒定
伊紅法：
1、試劑配制：
生理鹽水配置0.15%伊紅染液，備用。
2、細胞懸液制備：
 將生長有貼壁型細胞的培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液倒入干凈試管中，向培養(yǎng)皿中加入0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液1-2ml，靜置3-5min，待見到細胞變圓，彼此不連接為止，棄去混合消化液并將上述試管中的培養(yǎng)液倒回培養(yǎng)瓶中，用滴管輕輕吹打細胞，制成細胞懸液。
3、染色制片：
取0.5ml細胞懸液放于干凈的試管中，加1-2滴（約0.1ml）染液，混合，2min后制成臨時裝片，鏡檢。
4、染色結果：
死細胞染成紅色，活細胞不著色。
C.用血球計數(shù)板進行細胞計數(shù)
1、染色計數(shù)：
2、取上述步驟二所制備0.5ml細胞懸液放于干凈的試管中，加1-2滴（約0.1ml）染液，混合2-5min滴加少許染色后的細胞懸液于放有蓋片的血球計數(shù)板的斜面上，使懸液自然充滿計數(shù)板小室（注意：不要使小室內有氣泡產生，否則要重新滴加；在普通光鏡10物鏡下計數(shù)四個大格內的細胞數(shù)，壓線者數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右）。
2、根據(jù)染色結果計算活細胞率：
依據(jù)死細胞染成紅色、活細胞不著色的原則計數(shù)死細胞數(shù)和細胞總數(shù)，以如下公式計算細胞存活率：
活細胞率（%）=（細胞總數(shù)-死細胞數(shù)）/細胞總數(shù)*100%
【實驗結果】
A.細胞原代培養(yǎng)結果：
。
B細胞計數(shù)結果：

項目	1	2	3	4
細胞總數(shù)	85	60	81	58
活細胞數(shù)	29	11	14	12

每個中格平均細胞總數(shù)為71
平均活細胞數(shù)為17
活細胞率=活細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%=17/71*100%=23.9%
細胞密度=中格平均活細胞數(shù)×5×10000×稀釋倍數(shù)
        =17*5*10000*1
        =8.5*10⁵ /ml
【注意事項】
1、小鼠一定要將血放干凈并且在酒精中充分浸泡3min，防止雜菌污染無菌操作臺；
2、為近一步保證無菌操作臺的無菌環(huán)境，可在玻璃擋板口點一酒精燈，一般操作都在酒精燈火焰旁操作；
3、取小鼠脾時注意保持其完整，注入緩沖液要慢而準且適量，不要撐破脾臟，保證細胞分散游離出來，也不能使游離的細胞中含有塊兒狀物質；
4、培養(yǎng)液PH為7.0～7.4，其中加有酚酞，正常狀況細胞生長過程代謝物使PH下降，培養(yǎng)液的顏色改變呈黃色，因此可通過培養(yǎng)液顏色變化初步判斷細胞生長狀況；
5、生長狀況良好的細胞膜和核完整，細胞質透明，而細胞質出現(xiàn)較多顆粒狀或空泡證明細胞衰老。除游離期和衰退期外細胞一般貼壁生長。游離期細胞一般圓形，折光率高，而衰退期細胞皺縮，透明度下降，立體感很差，較易區(qū)分；
6、倒置顯微鏡將物鏡與載物臺間的空間解放，可以允許連同培養(yǎng)皿一同觀察。